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1)  yeast integrative plasmid
酵母整合型质粒
2)  yeast replicating plasmid
酵母复制型质粒
3)  yeast plasmid
酵母质粒
1.
Results: Compared with commercial yeast plasmid isolation kit, the efficiency and stability was no significant difference between the two methods.
目的:建立一种经济有效、快速简便、稳定的提取酵母质粒的方法。
4)  yeast centromeric plasmid
酵母中心粒质粒
5)  Pichia pastoris expression plasmid
酵母表达质粒
1.
Objective To construct a Pichia pastoris expression plasmid pPIC9K-GRA1,express dense granules antigen-1(GRA1) of Toxoplasma gondii,and to lay a foundation for further research the function of GRA1 protein.
目的构建弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)的酵母表达质粒,为进一步研究GRA1蛋白功能奠定基础。
6)  integrative plasmid
整合质粒
补充资料:甲醇酵母表达系统

甲醇酵母基因表达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生产系统。甲醇酵母是可利用甲醇作为唯一碳源的酵母,主要有h.polymorpha、candida bodinii、pichia pastoris三种,其中pichia pastoris作为基因表达系统使用得最多、最广泛[1]。与以往的基因表达系统相比,它具有无可匹敌的高表达特性,已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。

1. 外源蛋白质的基因在甲醇酵母中的高效表达

目前已有多种蛋白质的基因在该表达系统中克隆成功,包括蛋白酶、酶抑制剂、受体、单链抗体等(表1)。尽管各种外源蛋白质产生的水平不一,但各种蛋白质在甲醇酵母中的产生水平均为在细菌、昆虫或哺乳动物等表达系统中产量的10~100倍[2]。如表皮生长因子(egf)在酿酒酵母中的产量为7.4mg/l,而在甲醇酵母中为450mg/l,提高了60倍[3]。椐报道,外源蛋白质在甲醇酵母中的产量最高可达12g/l[9]。

2. 实现外源蛋白质高效产生的关键因素

2.1 表达载体 首先,甲醇酵母中没有稳定的质粒,所以其表达载体采用整合型质粒。利用醇氧化酶(甲醇代谢的关键酶)基因-1(aox1)的启动子(paox1)和转录终止子(3′aox1)构建成整合型表达载体。paox1是一个极强的启动子,醇氧化酶的产量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白质的30%[2],所以能使外源蛋白质在它的控制下高效产生。其次,在载体中加入酿酒酵母的分泌信号和前导肽序列(α因子)构建分泌型载体,一方面可以减轻宿主细胞的代谢负荷,另一方面可以减少宿主细胞蛋白水解酶对外源蛋白质的降解,ppic9k、pmetαa、b、c均为此类载体。此外,使多拷贝目的基因整合入甲醇酵母染色体,形成多个表达单元,产生高产的菌株,此类载体有pao815、ppic3.5、ppic9等。

2.2 受体菌 在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时,甲醇酵母中aox1基因的表达受到抑制,而在以甲醇为唯一碳源时,诱导基因表达,使外源蛋白质的产量更高。甲醇酵母适合高密度连续培养的条件,细胞干重达100g/l以上,蛋白质产量极高[14]。受体菌采用蛋白水解酶缺陷型,从而大大降低产物的降解。常用的甲醇酵母受体菌有gs115、km71、pmad11、pmad16等。

3. 应用前景

经过近几年的发展完善,甲醇酵母表达系统已日趋成熟,应用也日趋广泛。国内已有多篇在甲醇酵母中生产外源蛋白质成功的报道(表2)。美国invitrogen公司也已开发出多种新型的甲醇酵母表达系统试剂盒,如multi-copy pichia expression kit、easyselect pichia expression kit、pichia methanolia expression system等,利用甲醇酵母表达系统克隆一个外源基因已十分方便。相信随着对甲醇酵母研究的进一步深入,它在生产外源蛋白质方面将日益展示出诱人的前景。

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